- 02 基因工程技術(shù)的誕生（二）
- 03 基因工程技術(shù)的誕生（三）
- 04 基因工程技術(shù)的誕生（四）
- 05 基因工程技術(shù)的誕生（五）
- 06 基因工程技術(shù)的誕生（六）
- 07 限制性內(nèi)切核酸酶（一）
- 08 限制性內(nèi)切核酸酶（二）
- 09 限制性內(nèi)切核酸酶（三）
- 10 限制性內(nèi)切核酸酶（四）
- 11 限制性內(nèi)切核酸酶（五）
- 12 限制性內(nèi)切核酸酶（六）
- 13 限制性內(nèi)切核酸酶（七）
- 14 限制性內(nèi)切核酸酶（八）
- 15 限制性內(nèi)切核酸酶（九）
- 16 限制性內(nèi)切核酸酶（十）
- 17 限制性內(nèi)切核酸酶（十一）
- 18 限制性內(nèi)切核酸酶（十二）
- 19 限制性內(nèi)切核酸酶（十三）
- 20 DNA和RNA合成修飾酶（一）
- 21 DNA和RNA合成修飾酶（二）
- 22 DNA和RNA合成修飾酶（三）
- 23 DNA和RNA合成修飾酶（四）
- 24 DNA和RNA合成修飾酶（五）
- 25 DNA和RNA合成修飾酶（六）
- 26 DNA和RNA合成修飾酶（七）
- 27 DNA和RNA合成修飾酶（八）
- 28 質(zhì)粒的分子生物學(xué)與質(zhì)粒載體（一）
- 29 質(zhì)粒的分子生物學(xué)與質(zhì)粒載體（二）
- 30 質(zhì)粒的分子生物學(xué)與質(zhì)粒載體（三）
- 【中山大學(xué)】基因工程原理
- 32 質(zhì)粒的分子生物學(xué)與質(zhì)粒載體（五）
- 33 質(zhì)粒的分子生物學(xué)與質(zhì)粒載體（六）
- 34 質(zhì)粒的分子生物學(xué)與質(zhì)粒載體（七）
- 35 質(zhì)粒的分子生物學(xué)與質(zhì)粒載體（八）
- 36 質(zhì)粒的分子生物學(xué)與質(zhì)粒載體（九）
- 37 噬菌體載體（一）
- 38 噬菌體載體（二）
- 39 噬菌體載體（三）
- 40 噬菌體載體（四）
- 41 噬菌體載體（五）
- 42 噬菌體載體（六）
- 43 噬菌體載體（七）
- 44 噬菌體載體（八）
- 45 噬菌體載體（九）
- 46 噬菌體載體（十）
- 47 克隆策略（一）
- 48 克隆策略（二）
- 49 克隆策略（三）
- 50 克隆策略（四）
- 51 重組克隆的篩選與鑒定（一）
- 52 重組克隆的篩選與鑒定（二）
- 53 重組克隆的篩選與鑒定（三）
內(nèi)容提要
1. 基因工程又稱基因操作、重組DNA技術(shù), 是P. Berg等于1972年創(chuàng)建的。基因工程技術(shù)涉及的基本過(guò)程包括
“切、連、轉(zhuǎn)、選”。該技術(shù)有兩個(gè)基本的特點(diǎn)∶分子水平上的操作和細(xì)胞水平上的表達(dá)。
2. 基因工程中使用多種工具酶，包括限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和其他一些參與DNA合成與修飾的酶類。 3. 限制性內(nèi)切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，屬于水解酶類。根據(jù)限制性內(nèi)切核酸酶的作用特點(diǎn)，被分為
三大類。Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶是基因工程中最常用的酶，該類酶的分子量小，專一性強(qiáng),切割的方式有平切和交錯(cuò)切, 作用時(shí)需要Mg++作輔助因子, 但不需要ATP和SAM。第一個(gè)被分離的Ⅱ類酶是Hind Ⅱ。
4. 連接酶是一類用于核酸分子連接形成磷酸二酯鍵的核酸酶，有DNA連接酶和RNA連接酶之分。基因工程中
使用的連接酶來(lái)自于原核生物，有兩種類型的DNA連接酶∶E.coliDNA連接酶和T4-DNA連接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA連接酶，它是從T4噬菌體感染的E.coli中分離的一種單鏈多肽酶，既能進(jìn)行粘性末端連接又能進(jìn)行平末端連接。
5. 載體是能將分離或合成的基因?qū)爰?xì)胞的DNA分子，有三種主要類型∶質(zhì)粒DNA、病毒DNA、科斯質(zhì)粒，
在這三種類型的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的目的，出現(xiàn)了各種類型的改造載體。
6. DNA重組連接的方法大致分為四種: 粘性末端連接、平末端連接、同聚物接尾連接、接頭連接法。粘性末端
連接法是最常用的DNA連接方法,是指具有相同粘性末端的兩個(gè)雙鏈DNA分子在DNA連接酶的作用下, 連接成為一個(gè)雜合雙鏈DNA。平末端連接是指在T4 DNA連接酶的作用下, 將兩個(gè)具有平末端的雙鏈DNA分子連接成雜種DNA分子。同聚物加尾連接就是利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3"端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA連接酶的作用下, 連接成為重組的DNA。這種方法可適用于任何來(lái)源的DNA片段, 但方法較繁, 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用。將人工合成的或來(lái)源于現(xiàn)有質(zhì)粒的一小段DNA分子(在這一小段DNA分子上有某種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列), 加到載體或外源DNA的分子上, 然后通過(guò)酶切制造黏性末端的方法稱為接頭連接法。
7. 基因文庫(kù)分為基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)等，是指在一種載體群體中, 隨機(jī)地收集著某一生物DNA的各種克隆
片段, 理想地包含著該物種的全部遺傳信息。
8. DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞，使之無(wú)性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變
其遺傳性狀，這個(gè)導(dǎo)入過(guò)程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。目前常用的誘導(dǎo)感受態(tài)轉(zhuǎn)化的方法是CaCl2 法（圖3-20），此外也可以用基因槍等方法轉(zhuǎn)化外源DNA。 9. 重組體篩選有遺傳學(xué)方法、核酸雜交篩選法等。
10. 基因工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，目前在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療中已經(jīng)顯示了巨大的應(yīng)用前景，并形成了一大
批生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。
基因工程是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來(lái)源的基因(DNA分子)，按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品；或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能，揭示生命活動(dòng)規(guī)律。 基因工程技術(shù)誕生于20世紀(jì)70年代初，它是一門嶄新的生物技術(shù)科學(xué)，它的創(chuàng)立和發(fā)展使生命科學(xué)產(chǎn)生了一次重大飛躍，證明并實(shí)現(xiàn)了基因的可操作性，使人類從簡(jiǎn)單地利用天然生物資源走向定向改造和創(chuàng)造具有新品質(zhì)的生物資源的時(shí)代。 基因工程技術(shù)誕生至今已經(jīng)取得了輝煌的成就，成為當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最有生命力和最引人注目的前沿學(xué)科之一，基因工程也是當(dāng)今新的產(chǎn)業(yè)革命的一個(gè)重要組成部分。
