分子生物學(xué)技術(shù)簡(jiǎn)介隨著生命科學(xué)和化學(xué)的不斷發(fā)展，人們對(duì)生物體的認(rèn)知已經(jīng)逐漸深入到微觀水平。從單個(gè)的生物體到器官到組織到細(xì)胞，再?gòu)募?xì)胞結(jié)構(gòu)到核酸和蛋白的分子水平，人們意識(shí)到可以通過檢測(cè)分子水平的線性結(jié)構(gòu)（如核酸序列），來橫向比較不同物種，同物種不同個(gè)體，同個(gè)體不同細(xì)胞或不同生理（病理）狀態(tài)的差異。這就為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，提供了一個(gè)強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)。目前，常用的分子生物學(xué)技術(shù)有如下幾種[1]：
PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析
PCR- 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR- single strand conformation analysis,PCR- SSCP) 是近年來在基因突變檢測(cè)中運(yùn)用最廣泛的方法之一。PCR- SSCP 技術(shù)憑借突變可引起單鏈DNA三級(jí)構(gòu)象改變,通過觀察單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率漂移來判斷突變。樣品經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，其產(chǎn)物經(jīng)變性后可以產(chǎn)生2 條單鏈，如果存在基因突變，哪怕是一個(gè)堿基的異常，單鏈的構(gòu)象也會(huì)發(fā)生變化，正常與突變的DNA單鏈在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 中，可以顯現(xiàn)出不同的帶型，從而確定野生型和突變型，PCR- SSCP 分析的主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)易且敏感性較高。但是該技術(shù)不能確定突變的部位和性質(zhì)。PCR- SSCP 突變檢測(cè)敏感性隨PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度的增加而降低，一般用于檢測(cè)較小外顯子的突變。有時(shí)由于單個(gè)核苷酸變化所引起的構(gòu)象改變很小，用PAGE 電泳就可能無法檢出，在PCR 產(chǎn)物或待測(cè)DNA 小于200 bp 時(shí)，PCR- SSCP 分析能夠檢測(cè)出70%~ 95%的突變。如果以毛細(xì)管電泳代替PAGE，則可大為提高突變檢測(cè)的效率。
Wallace1997 年提出將PCR- SSCP 和異源DNA雙鏈分析（heteroduplex analysis,HA) 相結(jié)合，稱之為SSCP/ HA，部分PCR 產(chǎn)物經(jīng)變性進(jìn)行SSCP 分析以了解是否具有突變，其余PCR 產(chǎn)物直接用于電泳，以檢出含有突變的異源DNA雙鏈，電泳凝膠經(jīng)銀染，單鏈DNA所形成的帶為橘黃或棕色，而雙鏈DNA則表現(xiàn)為灰黑色。該綜合手段可以單鏈構(gòu)型多態(tài)性和異源雙鏈構(gòu)型分析兩個(gè)不同的層次檢出突變，是一種經(jīng)濟(jì)、迅速的突變檢測(cè)手段，但無法提供突變位置的信息。
PCR- SSCP 有許多改進(jìn)技術(shù)，如RNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性法（PCR- rSSCP）、雙脫氧測(cè)序單鏈片段構(gòu)象多態(tài)分析（PCR- ddF）、限制酶指紋技術(shù)(PCR- REF) 等。PCR- rSSCP 法依據(jù)RNA構(gòu)象對(duì)單個(gè)堿基替代更敏感的原理，在PCR 引物上加上某類啟動(dòng)子，通過轉(zhuǎn)錄的RNA構(gòu)象體的電泳遷移差異進(jìn)行突變鑒別。PCR- ddF 法把PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄，將轉(zhuǎn)錄物用反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行Sanger 雙脫氧終止測(cè)序反應(yīng)，通過觀察非變性膠上經(jīng)解鏈處理所產(chǎn)生的單鏈漂移、突變后終止片段的獲得與缺失來判斷突變。PCR- REF 法將RFLP 和SSCP 技術(shù)優(yōu)勢(shì)組合，將PCR 擴(kuò)增的待測(cè)片段用5~ 6 種限制酶依次消化，混合并進(jìn)行末端標(biāo)記，最后經(jīng)變性處理并在非變性凝膠上電泳分離，從而獲得來自片段長(zhǎng)度和片段構(gòu)象的雙重突變信息。
《分子生物學(xué)技術(shù)》共13章，第1章盡可能全面地?cái)⑹隽朔肿由飳W(xué)基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，內(nèi)容包括凝膠電泳、質(zhì)粒的制備、基因組DNA的制備和分析、總RNA的提取和分析、CDNA文庫的構(gòu)建、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、目的基因片段的克隆、Southern印跡、Northern印跡、Western印跡等。其余各章對(duì)一些特殊的實(shí)驗(yàn)技術(shù)或新技術(shù)進(jìn)行了經(jīng)驗(yàn)性質(zhì)的介紹，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織基因表達(dá)分析、報(bào)告基因技術(shù)、基因上游調(diào)控序列的分析、重組基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的制備、重組基因酵母菌表達(dá)產(chǎn)物的制備、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)誘導(dǎo)的基因定點(diǎn)突變、酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因、RNA干擾技術(shù)等。
