分子生物學技術簡介隨著生命科學和化學的不斷發(fā)展，人們對生物體的認知已經(jīng)逐漸深入到微觀水平。從單個的生物體到器官到組織到細胞，再從細胞結(jié)構(gòu)到核酸和蛋白的分子水平，人們意識到可以通過檢測分子水平的線性結(jié)構(gòu)（如核酸序列），來橫向比較不同物種，同物種不同個體，同個體不同細胞或不同生理（病理）狀態(tài)的差異。這就為生物學和醫(yī)學的各個領域，提供了一個強有力的技術平臺。目前，常用的分子生物學技術有如下幾種[1]：
PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析
PCR- 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR- single strand conformation analysis,PCR- SSCP) 是近年來在基因突變檢測中運用最廣泛的方法之一。PCR- SSCP 技術憑借突變可引起單鏈DNA三級構(gòu)象改變,通過觀察單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率漂移來判斷突變。樣品經(jīng)PCR 擴增后，其產(chǎn)物經(jīng)變性后可以產(chǎn)生2 條單鏈，如果存在基因突變，哪怕是一個堿基的異常，單鏈的構(gòu)象也會發(fā)生變化，正常與突變的DNA單鏈在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 中，可以顯現(xiàn)出不同的帶型，從而確定野生型和突變型，PCR- SSCP 分析的主要優(yōu)點是簡易且敏感性較高。但是該技術不能確定突變的部位和性質(zhì)。PCR- SSCP 突變檢測敏感性隨PCR 產(chǎn)物長度的增加而降低，一般用于檢測較小外顯子的突變。有時由于單個核苷酸變化所引起的構(gòu)象改變很小，用PAGE 電泳就可能無法檢出，在PCR 產(chǎn)物或待測DNA 小于200 bp 時，PCR- SSCP 分析能夠檢測出70%~ 95%的突變。如果以毛細管電泳代替PAGE，則可大為提高突變檢測的效率。
Wallace1997 年提出將PCR- SSCP 和異源DNA雙鏈分析（heteroduplex analysis,HA) 相結(jié)合，稱之為SSCP/ HA，部分PCR 產(chǎn)物經(jīng)變性進行SSCP 分析以了解是否具有突變，其余PCR 產(chǎn)物直接用于電泳，以檢出含有突變的異源DNA雙鏈，電泳凝膠經(jīng)銀染，單鏈DNA所形成的帶為橘黃或棕色，而雙鏈DNA則表現(xiàn)為灰黑色。該綜合手段可以單鏈構(gòu)型多態(tài)性和異源雙鏈構(gòu)型分析兩個不同的層次檢出突變，是一種經(jīng)濟、迅速的突變檢測手段，但無法提供突變位置的信息。
PCR- SSCP 有許多改進技術，如RNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性法（PCR- rSSCP）、雙脫氧測序單鏈片段構(gòu)象多態(tài)分析（PCR- ddF）、限制酶指紋技術(PCR- REF) 等。PCR- rSSCP 法依據(jù)RNA構(gòu)象對單個堿基替代更敏感的原理，在PCR 引物上加上某類啟動子，通過轉(zhuǎn)錄的RNA構(gòu)象體的電泳遷移差異進行突變鑒別。PCR- ddF 法把PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄，將轉(zhuǎn)錄物用反轉(zhuǎn)錄酶進行Sanger 雙脫氧終止測序反應，通過觀察非變性膠上經(jīng)解鏈處理所產(chǎn)生的單鏈漂移、突變后終止片段的獲得與缺失來判斷突變。PCR- REF 法將RFLP 和SSCP 技術優(yōu)勢組合，將PCR 擴增的待測片段用5~ 6 種限制酶依次消化，混合并進行末端標記，最后經(jīng)變性處理并在非變性凝膠上電泳分離，從而獲得來自片段長度和片段構(gòu)象的雙重突變信息。
《分子生物學技術》共13章，第1章盡可能全面地敘述了分子生物學基本的實驗技術，內(nèi)容包括凝膠電泳、質(zhì)粒的制備、基因組DNA的制備和分析、總RNA的提取和分析、CDNA文庫的構(gòu)建、聚合酶鏈式反應、目的基因片段的克隆、Southern印跡、Northern印跡、Western印跡等。其余各章對一些特殊的實驗技術或新技術進行了經(jīng)驗性質(zhì)的介紹，包括哺乳動物細胞和組織基因表達分析、報告基因技術、基因上游調(diào)控序列的分析、重組基因大腸桿菌表達產(chǎn)物的制備、重組基因酵母菌表達產(chǎn)物的制備、聚合酶鏈式反應誘導的基因定點突變、酵母雙雜交技術、噬菌體展示技術、哺乳動物轉(zhuǎn)基因、RNA干擾技術等。
